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        用MICA完成Caspase 3/7多色檢測

        發布時間:2022-11-28      點擊次數:564

        從成像到分析

        Caspases與細胞凋亡過程相關,因此可以利用caspase檢測來確定細胞是否正在經歷這種程序化的細胞死亡。這些檢測可以通過例如流式細胞儀、平板讀數儀實現,也可以在顯微鏡上完成,顯微鏡可為量化數據補充可見的結構信息。在這篇文章中,我們描述了MICA是如何用于caspase 3/7測定。借助Navigator或像素分類器等工具,MICA讓設置、執行和分析caspase 3/7檢測變得更加容易,即使沒有經驗的用戶也可輕松操作。

        圖像:雙色caspase檢測并進行拼接掃描。U2OS細胞用核標記物DRAQ5(品紅)和CellEvent™(黃色)標記。加入4mM星形孢菌素以誘導細胞凋亡。20倍物鏡下使用雙通道熒光,持續16小時每30分鐘獲取一次2x2 FOV(視野范圍)的掃描拼接圖像。

        介紹

        凋亡細胞檢測或者活細胞/死細胞檢測一般通過將某種物質應用于活細胞并觀察細胞反應,以此檢測其毒性或有效性。死亡率隨時間推移而上升或者劑量依賴性上升均證明物質有效。判斷潛在藥物的抗癌效果便是一個典型示例。

        商用染料試劑盒可檢測處于凋亡狀態的細胞。這些試劑盒內染料為熒光染料,能夠分別標記活細胞和死亡細胞。

        Caspase活性檢測法是細胞凋亡檢測法的一種。Caspase(半胱天冬酶)是參與細胞凋亡過程的一類半胱氨酸蛋白水解酶。它們還用于區分caspase介導的細胞凋亡或細胞壞死。

        這里的染料試劑盒使用的是DNA結合試劑,該試劑的熒光能夠被四氨基酸肽(DEVD)阻斷。一旦caspase-3和caspase-7(caspase-3/7)被激活,即當細胞處于凋亡狀態時,caspase-3和caspase-7便會切割DEVD肽,然后DNA結合試劑便會開始呈現熒光(見視頻1)。

        視頻 1:Capase-3/7活性檢測法原理:用核標記物DRAQ5(品紅)和CellEvent™Capase-3/7綠色熒光檢測試劑(Invitrogen™)(黃色)處理COS7細胞。CellEvent™是一種DNA結合染料。當capase-3/7切割四氨基酸肽(DEVD)后,該染料便會開始呈現熒光。因此,CellEvent™能夠檢測出處于capase-3/7介導凋亡過程中的細胞。添加星形孢菌素誘導細胞凋亡。使用63x物鏡,在明亮視野和兩個熒光通道下持續12小時每20分鐘獲取一次圖像。一段時間過后,處于凋亡狀態的細胞將被黃色熒光標記。

        挑戰

        由于添加劑濃度不同、孵育時間不同、染色類型或者細胞系不同等參數的不同,實驗通常在多孔板上進行。這種方法有兩個優點,一是能夠在一個反應容器中設置多個不同的試驗條件,二是只需要極少量的試劑和極低數量的細胞。

        但是,在實施過程中,用戶仍然可能會被不同孔和不同實驗的數量混淆。

        設置多孔板實驗時,MICA自帶的Navigator工具能夠幫助預覽。包括可以在虛擬畫板上計劃并設置每一孔的掃描拼接實驗或者延時實驗(見圖1)。

        圖1:導航工具。Navigator能提供整個樣品載體的預覽(例如,玻片、培養皿、孔板),并幫助用戶設置實驗。用戶能夠在整個孔板上操作導航并進入單孔內,比如界定感興趣區域或者設計掃描拼接。

        追蹤細胞活動需要使單一熒光通道的時空相關性成像。傳統的寬場顯微鏡一般一次記錄一個通道,因此每一個細胞結構只能按順序、一個接一個地記錄下來。這意味著兩個不同的結構記錄于兩個不同的時間點。這對于極速發生的細胞事件來說可能會產生影響,特別是在共定位研究中。

        同時成像通過在同一時間記錄全部熒光的方法規避了這一缺點。對于caspase活性檢測法而言,這意味著用戶能夠觀察到,例如在caspase-3/7被激活的瞬間線粒體的反應。

        MICA甚至能夠同時檢測四種熒光,使用戶可以同時觀察到除細胞核、caspase-3/7活性、線粒體等之外的另一個細胞結構(見圖5)。

        最后,如果想要確定某一特定試劑在誘導caspase介導細胞凋亡時的效果,則需要對caspase檢測進行量化。這種量化需要通過專門的外部軟件來實現。

        MICA自帶分析解決方案,不需要另外的軟件。通過MICA自帶的像素分類器,用戶能夠標記一些感興趣區域(ROI),人工智能算法通過這些標記區域能夠檢測所有其他的感興趣區域(見圖2)。對于caspase活性檢測法而言,細胞核信號可用于確定細胞總數。CellEvent™信號可用于識別caspase介導的凋亡細胞

        圖2:利用像素分類工具訓練MICA識別圖像中樣品特征。通過在圖像中標記示例特征,像素分類器能夠學會在圖像中復制輸入,劃分所有目標物。

        方法

        在這一案例研究中使用的檢測法中, U2OS細胞或者COS7細胞被鋪在96孔板,然后培養一整晚的時間。在實驗過程中,活細胞分別用DRAQ5、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分鐘。之后,更換培養基,在實驗結束前使用CellEvent™孵育細胞。每孔內加入凋亡誘導劑星形孢菌素(3 µM–7 µM)。

        在四色caspase活性檢測法中,U2OS細胞被接種在96孔板上并在夜間生長,然后培養一整晚的時間。在實驗過程中,活細胞與DAPI和TMRE孵育45分鐘。之后,更換培養基,在實驗結束前使用CellEvent™和SiR-Tubulin孵育細胞。每孔內加入凋亡誘導劑—星形孢菌素(3 µM–7 µM)。

        在37℃、5% CO2和~65%濕度的環境中,按照指示的時間間隔和持續時間用MICA進行活細胞成像。使用Navigator工具設定并執行檢測。一些實驗中會運行掃描拼接(參見視頻2)。進行掃描拼接時,研究人員使用的主要策略是“focus Map”;此外,延時實驗通過“Keep focus”來保持細胞的聚焦。


        視頻 2:三色caspase活性檢測的掃描拼接片。U2OS細胞分別用核標記SPY-650-DNA(藍色)、線粒體膜電位標記TMRE(品紅)和CellEvent™(黃色)處理。加入5mM星形孢菌素以誘導細胞凋亡。使用20x物鏡,在明亮視野和兩種熒光通道下,12小時內每15分鐘獲取一次2x2 FOVs(視野范圍)的掃描拼接圖像。隨著時間增加,Caspase活性增強,線粒體活性減弱。

        使用MICA自帶的分析功能進行本次實驗中的數據分析。其中核心組件之一便是人工智能驅動的像素分類器,該功能位于“學習”選項。

        通過像素分類器,用戶能夠標記其感興趣區域(ROI),該區域將作為所有要檢測的其他區域的示例。如圖5所示,細胞核被像素分類器標記并檢測。像素分類器同樣能夠標記并檢測線粒體活性標識TMRE和caspase呈陽性的細胞。之后會在整個延時攝影過程中分析這批圖像。

        經過計算之后,MICA會將計算結果以散點圖、共定位圖、直方圖、餅狀圖、框圖或者時間序列圖的形式展示在“結果”選項中。

        圖3:在分析過程中,MICA會標記作為樣例的感興趣區域,為人工智能驅動的分析功能提供信息。在此檢測法中,細胞核(品紅)和caspase陽性細胞(綠色)會被用于訓練像素分類器,通過這種方式,像素處理器便有能力分析caspase介導的凋亡細胞比例。

        結果

        SPY-650-DNA(標記細胞核)和CellEvent™(標記caspase 3/7活性)兩種細胞染料的量化研究揭示了在活細胞實驗中發生caspase介導的凋亡的細胞。細胞核的數量(此處選擇“范圍”參數做類比)說明了每張圖像中細胞的數量(同選“范圍”),可與處于凋亡過程中細胞的數量(同選“范圍”)相對應。另一個標記,即TMRE成像過程,揭示了線粒體活性。

        量化數據(如長度、寬度、面積)顯示在采集圖像下方的表格中,這些數據可被導出為Excel表格。獲取的圖像可以在延時成像的每一個時間點上查看,并可以與識別的ROI重疊。

        三色caspase 3/7活性檢測圖(圖4)顯示,細胞核信號在開始的時候增強,之后逐漸減弱。信號增強是因為核染色劑必須與DNA結合,這一結合過程需要一定的時間。另一方面,SPY-650-DNA信號減弱是因為細胞核解體,解體現象見相關圖像。

        其他信號要么隨時間增加而增強(CellEvent™),要么隨時間增加而減弱(TMRE): caspase介導的凋亡細胞數量增加的同時激活狀態的線粒體數量減少。

        圖4:三色caspase 3/7活性檢測法量化研究。通過像素分類器檢測細胞核、TMRE和caspase陽性細胞,以確定在不同濃度的星形孢菌素下,隨著時間的推移發生caspase介導的凋亡的細胞數量。TMRE信號能反映線粒體的健康狀態。結果可以多種形式展示,比如時間序列圖。

        用戶可以通過MICA一次性對四種熒光成像。在caspase 3/7活性檢測法中,這有助于調查凋亡過程中額外的細胞成分的命運—實現*時空相關性。圖5中展示的案例顯示,除了細胞核(DAPI)、激活狀態的線粒體(TMRE)以及caspase陽性細胞(CellEvent™)以外,也對肌動蛋白細胞骨架(SiR-Actin)進行了染色。

        高倍率下(63x),用戶能夠看到,caspase被激活之后,肌動蛋白細胞骨架坍塌。與此同時細胞核以及線粒體停止工作。因為所有通道都是在一次拍攝中獲得的,各細胞活動成像之間存在精確聯系。

        圖5:四色caspase-3/7檢測,用SiR-Actin、TMRE(線粒體活性)、CellEvent™(caspase活性)以及DAPI(細胞核)標記U2OS細胞。在時間點0加入星形孢菌素。在63x高倍、寬場模式以及THUNDER(ICC)成像模式下獲得的圖像。

        結論

        Caspase活性檢測法為研究抗癌藥物提供了新的見解。為了實現這一目標,研究人員必須在保證高時空精準度的情況下將活細胞從凋亡細胞中區分出來。

        對于統計上可靠的結果,增加量很有必要。這就是為什么這類實驗必須在孔板上進行,也必須進行量化研究。

        MICA滿足以上全部要求。在FluoSync的幫助下,Mica可同時保證多達4種不同的熒光染料可以同時成像,不論是在單一培養皿上,還是在96孔板上。MICA完整的培養系統能夠培育活細胞數日,同時其自帶的基于人工智能的分析功能也有助于用戶獲得可靠的數據。

         

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