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        如何對熒光結構三維定位以進行冷凍FIB切片

        發布時間:2022-11-28      點擊次數:538

        冷凍共聚焦顯微鏡及其在冷凍電子斷層掃描中的價值

        冷凍ET(電子斷層掃描)是一種專用的透射電子顯微鏡技術,可以重建觀察區域的三維體積。借助先進的冷凍EM(電子顯微鏡),圖像分辨率可以提升到令人難以置信的亞納米等級。因此,可以在細胞內的原生環境中研究蛋白質以及其他生物分子,從而揭示尚未探明的分子機制。由于細胞和組織必須薄到能夠透過電子,樣品必須進行切片以獲取足夠薄的樣品體積(薄層)。為對樣品中的靶區進行精確的三維定位,冷凍共聚焦顯微鏡是bi bu ke shao的工具。

        以下部分,我們將描述冷凍電子斷層掃描工作流程的主要步驟,以及如何通過冷凍共聚焦顯微鏡定位靶區并進行切片,以提高整個工作流程的可靠性。


        在EM網格上培養細胞

        通常,在涂有多孔碳膜(例如 QuantifoilR)或二氧化硅(SiO2)膜的金質或鈦金網格上植入急性分離或培養的細胞(圖1,Mahamid等人,2019)在后續步驟中,鈦金屬和二氧化硅似乎更加堅硬而且穩定,無需額外添加碳層(Toro-Nahuelpan 2019) 網格通過Poly-L-Lysin或纖連蛋白(Fibronectin)實現生物激活,胰蛋白酶解離細胞在前一晚植入,以便在后續步驟中附著在碳層表面(Mahamid等人,2019)。

        圖1:采用12納米厚多孔二氧化硅膜(R 1.2/20,即孔徑1.2微米,間距20微米)的3毫米EM金質(Au)網格的反射圖像拼接圖。HeLa細胞已經植入并玻璃化。實心箭頭:定位用的中心標記;空心箭頭:聚焦離子束進入的切片槽;虛線箭頭:空的網格方格。一個網格方格的邊長:90微米。


        添加微型圖案

        為進入細胞樣品以成功實現FIB切片并在冷凍TEM中開展后續分析,必須確保相關細胞位于網格方格的中心位置或其附近。但細胞喜歡在網格條上生長或者集簇生長,因此不適合進行FIB切片和電子透射分析。為了克服這一挑戰,微型圖案技術允許用戶控制細胞在碳膜(圖2)上的位置和分布,提高相關工作流程的可靠性。 網格表面涂有聚乙二醇(PEG),可防止生物材料附著。利用紫外激光移除該涂層,即可對細胞的黏附進行針對性控制,保證FIB切片以及TEM的可操作性(Toro-Nahuelpan 2019)。此外,可以創建特定圖案,從而影響整個細胞結構并且有助于使用冷凍電子顯微鏡研究生物力學現象。

        圖2:有/無微型圖案的細胞分布情況左圖:分布不均的細胞(小鼠A9成纖維細胞,使用Alexa Fluor 488 Phalloidin標記,以顯示纖維狀肌動蛋白)。右圖:網格方格中心定位精確的細胞,可進行FIB(成纖維細胞黏附在纖維蛋白原微型圖案表面;圖片由Alvéole與德國漢堡CSSB中心教授Kay Grünewald博士共同提供。)

        投入冷凍

        為在固定用于電子顯微鏡檢查的同時確保樣品接近原生狀態,細胞必須極速冷凍,以免產生破壞性的冰晶。這個過程稱為玻璃化,因為冰片變成無結晶的玻璃狀(玻璃體)。

        為讓樣品細胞達到這種效果,網格必須快速投浸到適當的冷凍劑(通常為乙烷,或者乙烷和丙烷)中。1981年,Jacques Dubochet發表了shou ge手動吸液和投入冷凍方法,該方法仍獲廣泛使用以獲取出色的結果(Dubochet, J.以及McDowall, A. W.,1981)。

        在投入冷凍之前,必須去除多余的液體。標準技術是使用濾紙實現受控吸液(圖3,Dubochet, J等人,1982;Bellare等人,1988;Frederik, P. M.等人,1989)。

        圖3:在投入冷凍前,通過吸液處理對多余液體進行受控移除。使用鑷子固定網格,并通過單獨步驟將吸液紙移向網格。吸液傳感器可以自動并反復執行該過程。

        市面上有多種不同的吸液設備,例如用于自動吸液和投入冷凍的Leica EM GP2。根據不同樣品類型的多種需求,可以使用多種涉及吸液步驟的樣品制備方案(另見此處)。


        冷凍狀況下的存儲、裝載和轉移

        玻璃化之后,樣品必須在整個工作流程期間處于冷凍狀況下。因此,必須對從存儲到轉移至不同成像系統的所有步驟進行冷凍處理,以免樣品析晶和/或污染這尤其困難,因為這種低溫冷凍樣品會像磁鐵一樣吸引附近的濕氣和灰塵。研究人員和制造商付出巨大的努力來開發并提供解決方案,以便在工作流程的不同步驟中保證樣品安全。

        樣品通常以四個為一組存儲在網格盒內,而網格盒又保存在大型液氮(LN2)罐中的Falcon多孔試管中。還可以使用更為復雜的冰球系統。

        轉移并裝載到樣品架時,通常使用液態氮(LN2)。不幸的是,LN2往往會在一段時間后,因為空氣中的水分而產生結晶冰污染。在轉移時,這些冰晶可能會附著到網格上,干擾隨后的切片和成像過程。此外,LN2內部的能見度很低,因為它在不斷移動,而且始終會有條紋。

        因此,最好在LN2上部的氣相部分裝載并轉移樣品以保持冷凍條件,同時為裝載步驟(圖4)提供出色的可見性。 徠卡顯微系統在提供GN2(氣態氮)裝載和轉移設備方面擁有30多年的悠久歷史。新的冷凍顯微鏡套件就在這些經驗的基礎上開發而成,同時融合眾多客戶的反饋意見打造出先進的轉移艙和夾具系統。

        圖4:在冷凍顯微鏡套件轉移艙的GN2(氣態氮)環境中裝載網格。轉移艙的可見度在冷凍條件下不受干擾。


        檢查樣品質量和靶分布

        在冷凍工作流程中,一般而言,EM操作時間尤其寶貴,因此對樣品進行早期質量檢查至關重要。許多因素會關系到樣品能否轉移到下一個工作流程步驟,包括碳箔的結構完整性、玻璃化的質量(包括冰層的厚度及其分布)、目標細胞的存在、分布和可及性,以及目標結構的存在和定位。

        所有這些參數均可通過基于相機的冷凍光學顯微鏡(例如THUNDER Imager EM Cryo-CLEM)或使用STELLARIS冷凍共聚焦顯微鏡上的相機模式來檢查(圖5)。

        透射模式顯示網格、箔膜和細胞質量,反射圖像顯示網格表面,尤其是呈現玻璃化質量和冰層厚度,而熒光圖像可以提供有關不同靶蛋白的表達水平及其分布情況的信息。

        圖5:不同模式呈現出網格的完整性以及靶分布。A——網格表面的反射圖像可以顯示碳膜或二氧化硅層的缺陷以及冰層的厚度。B——綠色熒光(線粒體)。C——液滴分布以實現高精度關聯D——通過Hoechst標記的細胞核E——所有模式的疊加圖像細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。一個網格方格的邊長:90微米。

        在LAS X Coral Cryo軟件工作流程中,用戶可以在引導下,通過不同圖像模式對整個網格自動創建清晰的合焦概覽圖像。


        標記標志點、薄片點以及液滴中心

        為了關聯冷凍LM(光學顯微鏡)的3D圖像以及后續的冷凍FIB-SEM/TEM圖像,首先需要獲取網格的概覽圖像以便大致對齊兩種模式的圖像(圖6)。這里,反射圖像非常重要,因為它們類似于SEM圖像,但也可以使用透射圖像。中心標記以及其他標志點(例如碳層中的缺陷)有助于快速定位并對齊概覽圖。

        圖6:以不同模式獲取整個網格的合焦概覽圖像,用于識別網格缺陷、對齊標記和靶分布。中心標記用實心箭頭表示,二氧化硅層中的主要缺陷用空心箭頭突出顯示。HeLa細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。藍色 – Hoechst染料,細胞核;綠色 — 線粒體綠色熒光探針,線粒體;紅色 - 深紅色液滴和Bodipy熒光染料,脂滴。一個網格方格的邊長:90微米。完整網格直徑:3毫米。

        其次,需要超分辨率的共聚焦3D圖像。這些圖像堆棧用于在潛在薄片位置的范圍內執行高精度關聯。完成概覽圖對齊后,可以找到3D共聚焦堆棧的正確位置以便后續進行高精度關聯這樣做的前提是必須提供圖像相對于概覽圖以及相對于彼此的位置。這就是Coral Cryo軟件工作流程之后的處理步驟(圖7)。

        圖7:相機概覽圖像與共聚焦Z-堆棧相機和共聚焦圖像的組合含有XY坐標位置,因此可以匹配。所有圖像都包含在Coral Cryo軟件工作流程期間創建的相關項目文件夾中。HeLa細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。藍色 – Hoechst染料,細胞核;綠色 — 線粒體綠色熒光探針,線粒體;紅色 - 深紅色液滴和Bodipy熒光染料,脂滴。一個網格方格的邊長:90微米。完整網格直徑:3毫米。


        必須組合相機概覽圖像和超分辨率3D圖像以檢索靶區位置并在FIB-SEM上定義切片位置。這個步驟非常重要,因為在標準FIB-SEM中,無法看到熒光以及相應的靶區點位。

        EM(電子顯微鏡)制造商近期研發出一種集成了FIB-SEM功能的熒光顯微鏡,可以作為在切片過程中通過檢查熒光來提高工作流程的可靠性和準確性的一種jue jia選擇。不過,這些系統并不具備必要的分辨率以及采集模式的靈活性,無法像單獨的共聚焦系統那樣實現精確的3D定位。


        如何關聯并檢索薄片位置

        作為常用的zui di標準,研究人員使用LM圖像的屏幕截圖在EM上檢索靶區的XY坐標。不幸的是,并排比較圖像不僅費力耗時而且很容易出錯,因此并不可靠。身為工作流程提供商,徠卡顯微系統致力于通過THUNDER Imager EM Cryo-CLEM來改善這種情況。研究人員可以在圖像上定位標志點和靶區標記,然后以開放EM格式的完整坐標集導出。首先,這個流程適用于2D圖像,因此合乎邏輯的下一步驟就是提高分辨率并將坐標系擴展到3D坐標。

        對于高精度關聯和3D定位,目前廣泛采用的是基于液滴的方法(Alegretti等人,2020;Klumpe等人,2021年;Bieber, A.,Capitanio, C等人,2021)液滴通常在玻璃化之前添加到細胞中,可在LM和EM中觀察到,用于通過XYZ坐標對齊圖像堆棧,作為圖像數據相關性的基礎,從而正確定位FIB切片窗口(圖8)。

        典型液滴的尺寸為1微米,wan quan呈球形,這使其中心坐標能夠進行亞衍射擬合。通過SEM中的背散射電子,可以更清晰地觀察到含有金屬的微滴,從而將它們與大小相似的冰晶區分開來。優先選擇液滴,使其熒光發射不同于實際靶的熒光發射,以便能夠更好地分辨。

        圖8:3D共聚焦圖像(左)和俯視SEM圖像(右)的最大投影。熒光液滴(1微米)在兩種模式中均可以觀察到,因此可以用于對齊數據。SEM圖像細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Herman K. H. Fung和Ievgeniia Zagoriy友情提供。一個網格方格的邊長:90微米。


        要使用來自冷凍LM和FIB-SEM的3D數據,在冷凍LM的引導下,進行薄片制備,可以使用一款開源軟件(3D關聯工具箱,簡稱3DCT,Jan Arnold等人,2016)。

        將冷凍LM圖像載入到在FIB-SEM上運行的該軟件中。二維LM概覽圖和SEM圖像之間的三點關聯用于初步定位。之后,使用離子束獲取相關視場,并手動點擊LM堆棧和FIB圖像中的相同液滴圖10顯示了一張LM圖像和一張FIB圖像,其中的靶區點位以及液滴可以在定位軟件中重現其排列組合。

        圖9:在LM和FIB圖像中關聯標記。左圖:點擊觀察結構周圍的液滴,并在3D圖像中執行質心定義(白圈中的綠點)計算得到的位置隨后投影到FIB圖像(右圖)上根據液滴標記,計算目標結構的位置并標記到FIB圖像中(紅圈中的紅點)。離子束圖像由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺:20微米。


        該軟件通過對X、Y、Z信號進行高斯擬合,精準確定液滴的中心。近期的改進增加了半自動液滴檢測功能以及其他功能,從而更加方便地執行冷凍FIB工作流程。(SerialFIB, Klumpes等人,2021)。

        在網格條上選擇圍繞最終目標結構的幾處液滴,作為切片處理的坐標系?;居嬎惴椒ㄊ强紤]縮放、旋轉以及平移之后的線性仿射變換最后,在LM圖像中選擇目標結構并疊加到FIB圖像上。

        根據目標結構的位置,就可以定位切片窗口(圖10)

        圖10:定位切片窗口左:離子束細胞圖像,含有標記液滴和目標結構根據目標結構的計算位置,在所用FIB-SEM的切片軟件中,交互定位上下切片窗口的位置(細薄條紋上方和下方的紅色方塊)。圖像由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺:20微米。


        Coral Cryo工作流程具有哪些優勢?

        Coral Cryo軟件工作流程旨在為基于液滴的靶區定位工作流程提供支持。它可以提供創建合焦相機概覽圖像所需的成像作業(圖6和圖7)。所有必要的自動對焦功能均可以正確調整并分配,并且可以標記潛在薄片位置,同時能夠在定義的位置執行超分辨率共聚焦Z-堆棧。

        在定位管理器(圖11)中,可以確定所有必要的坐標標記,并且以開放格式(*.xml)提供。此類圖像會自動保存,其數據格式可以導入任何FIB-SEM軟件。

        圖11:Coral Cryo軟件模塊標記點、薄片和液滴標記均可以在軟件工作流程中定義。反射圖像中細胞的頂部和底部坐標值可以作為在FIB SEM中正確計算靶區3D位置的額外參考。本文前述部分圖像中的相同細胞經過突出顯示,用于標記定義。

        對齊標記用于使用相機概覽圖像對標記點進行初步的粗略對齊。薄片標記具有雙重用途:作為進行超分辨率共聚焦3D掃描的位置標記,或者在圖像采集后,作為靶結構的精確3D標記。亞像素插值確保該階段可以在3D圖像內進行高精度定位。最后,插值方法還用于標記液滴坐標,以便在FIB-SEM上進行后續液滴關聯。


        冷凍FIB切片

        進行必要的關聯并設置切片窗口,薄片位置通常會粗略切薄至大約1微米,隨后進行最終的拋光步驟以達到電子透明(圖12)。

        圖12:目標薄片的離子束圖像以及SEM俯視圖圖像由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室(EMBL)Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺:10微米。采用兩步方法的原因在于冰污染和/或切片材料可能會沉積在薄片上。為避免在最終薄片上發生冰污染,建議采用快速拋光工藝(Schaffer M.等人,2017)。還可以采用開源的商業軟件,以自動方式進行切片。


        冷凍透射電子顯微鏡

        進行冷凍FIB切片之后,含有薄片的網格轉移至冷凍TEM,通過對網格(連同薄片)逐漸傾斜,采集一系列斷層掃描圖像。圖像經過計算處理以重建所記錄體積的3D斷層掃描圖像。通過對樣品的多個圖像取平均值,可以降低固有噪點,從而對蛋白質或蛋白質復合物等顆粒獲得更高分辨率的結構。這種處理方式稱為亞斷層圖像平均(Wan和Briggs,2016;Zhang 2019)。從概念上說,這相當于通過單顆粒成像(SPA),在原位實現對大分子的亞納米分辨率。


        總結

        本文旨在表明冷凍共聚焦顯微鏡是冷凍工作流程中的一個重要組成部分,用于評估EM網格上玻璃化樣品的質量和靶分布。在冷凍條件下記錄的高分辨率共聚焦數據使科學家能夠在3D熒光下識別目標結構。此外,3D體積可作為相關方法的參考,以便在FIB-SEM中檢索靶結構進行切片,然后在冷凍TEM中進行電子斷層掃描,以獲得靶區的亞納米分辨率圖像。

        Coral Cryo工作流程搭配新的共聚焦平臺STELLARIS,再加上Coral Cryo軟件,可以幫助新手用戶創建網格概覽圖像、超分辨率3D圖像以及精確的坐標標記,為后續的FIB切片和冷凍電子斷層掃描奠定堅實基礎。

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